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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章細(xì)菌突變試驗

細(xì)菌突變試驗

更新時間:2019-04-11點擊次數(shù):1599

      電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機,玻璃器皿、生物安全柜等。

      培養(yǎng)基和試劑

      0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液

成分:

L-組氨酸(MW155)

78mg

 

D-生物素(MW244)

122mg

 

L-色氨酸(MW204)

102mg

 

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

       配制:將上述成分加熱,以溶解生物素,然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。若試驗中不使用大腸桿菌,則不添加色氨酸。

        頂層瓊脂培養(yǎng)基

成分:

瓊脂粉

1.2g

 

氯化鈉

1.0g

 

加蒸餾水/去離子水至

200mL

        配制:上述成分混合后,于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時,加入0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL。若試驗中不使用大腸桿菌,則不添加色氨酸。

         Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E

成分:

枸櫞酸(C6H8O7·H2O)

100g

 

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

500g

 

磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O)

175g

 

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

10g

 

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

      配制:先將前三種成分加熱溶解后,再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中,加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

       20%葡萄糖溶液

成分:

葡萄糖

200g

 

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

      配制:加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖,再加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。

      底層瓊脂培養(yǎng)基

成分:

瓊脂粉

7.5g

 

蒸餾水/去離子水

480mL

 

V-B培養(yǎng)基E

10mL

 

20%葡萄糖溶液

10mL

       配制:首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后,再加入后兩種成分,充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板,冷凝固化后倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中24h,備用。

      營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

成分:

:C8H9Cl

2.5g

 

胰胨

5.0g

 

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

1.0g

 

加蒸餾水/去離子水至

500mL

      配制:將上述成分混合后,于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)

成分:

(KCl)

61.5g

KCl

氯化鎂(MgCl2·6H2O)

40.7g

 

加蒸餾水/去離子水至

500mL

      配制:在水中溶解上述成分后,于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

成分:

磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)

2.965g

 

磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)

29.015g

 

加蒸餾水/去離子水至

500mL

      配制:溶解上述成分后,于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      S9混合液

成分:

每毫升S9混合液

 

肝S9

100μl

 

鹽溶液

20μl

 

滅菌蒸餾水/去離子水

380μl

 

0.2mol/L磷酸鹽緩沖液

500μl

 

輔酶II(NADP)

4μmol

 

6-磷酸葡萄糖(G-6-P)

5μmol

       配制:將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重,然后按上述相反的次序加入各種成分,使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配,并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束,剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。

       菌株鑒定用和特殊用途試劑

       組氨酸-色氨酸-生物素平板

成分:

瓊脂粉

15g

 

蒸餾水/去離子水

934mL

 

(V-B)培養(yǎng)基E

20mL

 

20%葡萄糖

20mL

 

滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

滅菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

       配制:高壓滅菌瓊脂和水后,將滅菌20%葡萄糖,V-B培養(yǎng)基、組氨酸溶液,加進熱的瓊脂溶液中(若試驗中不使用大腸桿菌,則不添加色氨酸,同時蒸餾水/去離子水改為944mL)。待溶液稍微冷卻后,加入滅菌生物素,混勻,澆制平板。

       氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板

成分:

瓊脂粉

15g

 

蒸餾水/去離子水

930mL

 

(V-B)鹽溶液

20mL

 

20%葡萄糖

20mL

 

滅菌鹽酸組氨酸溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

滅菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

 

氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L NaOH中)

3.15mL

 

四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)

0.25mL

         配制:瓊脂和水高壓滅菌20min,將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液,加進熱的瓊脂溶液中,混勻(若試驗中不使用大腸桿菌,則不添加色氨酸,同時蒸餾水/去離子水改為加940mL)。冷卻至大約50℃,無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。

         應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi),制備主平板。

         營養(yǎng)瓊脂平板

成分:

瓊脂粉

7.5g

 

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

500mL

        配制:于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。

      試驗菌株及其生物學(xué)特性鑒定

      試驗菌株

采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合:

鼠傷寒沙門氏菌TA1535;

鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537;

鼠傷寒沙門氏菌TA98;

鼠傷寒沙門氏菌TA100;

鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA(pKM101);

      生物學(xué)特性鑒定

新獲得的或長期保存的菌種,在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。

以上內(nèi)容僅供參考!

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